Les caractérisations, analyses, séparations, purifications des molécules biologiques (peptides, protéines, oligonucléotides) sont indispensables pour identifier ou pour obtenir une molécule la plus pure possible en vue de son utilisation en tant que molécule thérapeutique ou encore pour connaître son rôle dans l’organisme, sa structure et ses interactions.

Il existe un grand nombre de techniques d’analyse ou de purification (Ultrafiltration – Electrophorése-Protéomique- Cristallographie – Chromatographie).
Dans cet article, nous nous intéressons aux techniques chromatographiques : Phase Inverse (RP), Echanges d’ions (IEX), Chromatographie d’exclusion (SEC), Interactions Hydrophobes (HIC), Interactions Hydrophiles (HILIC), Affinité (AFC).

Les différentes techniques analytiques permettent de connaître la séquence peptidique d’une protéine, d’analyser les aggrégats protéiques ou bien de distinguer les isoformes, les variants de charges ou de glycosylation et également de séparer les ADC – Antibody Drug Conjugate.

Ces étapes analytiques sont un préalable indispensable à la connaissance parfaite de la molécule que nous aurons à purifier.

Anticorps

 

Les différentes techniques chromatographiques le plus souvent employées sont les suivantes :

1. Phase inverse (RP) :

Séparations des molécules en fonction de leur hydrophobicité

2. Echanges d’ions (IEX) :

Séparations des molécules en fonction de leurs charges globales

3. Affinité (AFC) :

Séparations des molécules en fonction de leur affinité avec la protéine A, G ou L ou des ions métalliques (technique IMAC – Immobilized Metal Affinity Chromatography)

4. Chromatographie d’exclusion (SEC):

Séparations des molécules en fonction de leurs tailles

5. Interactions hydrophobes (HIC) :

Séparations des molécules en fonction de leur hydrophobicité

6. Interactions Hydrophiles (HILIC) :

Séparations des molécules en fonction de leur hydrophilicité

 

Biomolécules

Analyse & Purification des Biomolecules

 

Principe basique de la chromatographie

Dans une colonne, une phase mobile pousse les analytes à travers des billes (de silice, d’agarose, de polyméres) :
C’est le principe de “diffusion
En fonction des interactions proposées, les analytes sont plus ou moins retenus

Principe de diffusion

Techniques chromatographiques

1. Phase Inverse – RP

La technique RP – Phase Inverse – sépare les molécules en fonction de leurs caractéristiques d’hydrophobicité.

RPC

Avantages

  • Très grande résolution
  • Impuretées spécifiquement éliminées
  • Concentration des échantillons
  • Elution des échantillons : eau & solvants organiques

Désavantages

  • Dénaturation des protéines
  • Haute pression
Peptide Mapping

La RP est très efficace pour les purifications des peptides et les analyses des protéines.
Rarement utilisé pour les purifications des protéines instables dans les solvants organiques (technique destructive).

2. Echanges d’Ions – IEX

La technique IEX – Echanges d’Ions – sépare les molécules en fonction de leur charge globale de surface. Si la molécule d’intérêt est chargée négativement nous parlerons d’échanges d’anions, si la molécule est chargée positivement nous parlerons d’échanges de cations.

IEX : Ion Exchange Chromatography

Avantages

  • Grands débits, grande sélectivité
  • Grande capacité
  • Grand rendement
  • Concentration des échantillons

Désavantages

  • pH dépendant
  • Les protéines purifiées se trouvent dans un tampon avec une grande concentration saline
  • L’échantillon doit être chargée sur la colonne dans un tampon de faible concentration saline
Analyse des variantes de charge

 

3. Affinité – AFC

La technique d’affinité sépare les molécules en fonction de leur ”affinité” avec un support active. Il s’agit d’une séparation sélective d’une biomolécule de ses formes inactives ou dénaturées.

Analytical Purification Technics : Affinity

Avantages

  • C’est LA technique de purification la plus efficace
  • Sélectivité optimale
  • Grande résolution
  • Grande capacité

Désavantage

  • Coût
IMAC

 

4. Chromatographie d’exclusion – SEC

La technique SEC sépare les molécules en fonction de leur taille ou de leur encombrement.
L’élution est inversement proportionnelle au radian hydrodynamique des molécules – les grosses molécules sortent en premier.

La technique SEC est utilisée dans les études d’aggrégations et de re-conformations des protéines ainsi que dans le dessalage des solutions protéiques.

Sise Exclusion Chromatography - SEC

Avantages

  • Rapidité et efficacité pour les dessalages
  • Conditions douces et grand rendement
  • De nombreux tampons peuvent être utilises
  • Elimination des aggrégats
  • Plusieurs colonnes peuvent être utilisées en série pour augmenter la résolution

Désavantages

  • Volume d’échantillon limité
  • Dilution des éluats
  • Technique longue
Analytical Purification Technics : SEC

 

5. Interactions Hydrophobes – HIC

La technique HIC sépare les molécules en fonction de leur charge globale de surface.

Cette technique est pH et force ionique dépendante.

La technique HIC est particulièrement bien adaptée aux purifications des ADC – Antibody Drug Conjugate – lesquels sont des complexes moléculaires constitués par un anticorps monoclonal sur lequel sont greffées des molécules chimiques à activités thérapeutiques.

IEX : Ion Exchange Chromatography

Avantages

  • Conditions douces et donc non destructive
  • Excellent rendement
  • Echantillons élués avec des faibles concentrations salines
  • Parfaitement adaptée avant les gels filtrations, les échanges d’ions ainsi que les affinités

Désavantages

  • Le tampon de l’échantillon à purifier doit être avoir une grande force ionique – grande concentration saline
  • La résolution étant limitée, des étapes complémentaires de purification doivent être suivies
Antibody Drug Conjugate separation - HIC

HIC

 

6. Interactions Hydrophiles – HILIC

La technique HILIC sépare les molécules en fonction de leur hydrophilicité.

Cette technique est avant tout dédiée aux analyses des molécules glycosylées (Glycans).

RPC

Avantages

  • Très grande résolution
  • Impuretées spécifiquement éliminées
  • Concentration des échantillons
  • Elution des échantillons : eau & solvants organiques
  • Compatible MS

Désavantages

  • Dénaturation des protéines
  • Dès pH >3, il y a une proportion non négligeable de groupements silanols déprotonés (≡ Si-O-) qui peuvent déclencher des processus d’échanges de cations
Glycan analysis - HILIC

Cette technique, très efficace pour les purifications des variants de glycosylation, est rarement utilisée pour les purifications des protéines instables dans les solvants organiques (technique destructive)

La technique HILIC est l’inverse de la chromatographie en phase inverse.

Le support chromatographique est hydrophile et la sortie des molécules est de la moins polaire à la plus polaire qui est l’ordre inverse de la phase inverse.